小白生信学习记（三）转录组分析流程

      这周开始，正式进入RNAseq分析部分。

      在分析数据的过程中，其实会有很多需要了解的细节，这些细节需要大家通过自己查找文献等方式进行补充。这个系列的写作目的主要是带着大家实际上机操作，快速走一个分析的框架，学会软件安装、基本linux命令及R语言等等。而分析流程中的其他许多重要的东西，会逐渐在后续的写作中去详细讲解、逐步完善。

      转录组测序分析可以分为有参转录组分析和无参转录组分析。有参无参的意思是，有/无参考基因组。通常模式动植物基本都会有参考基因组。而这里仅以有参转录组分析为例。

      有参转录组的分析流程大体是这样的：

        我们从下机数据开始说起。

        在测序之前，通常合同上会规定交付的数据量，以及测序质量符合什么样的要求：比如平均Q20≥85% ，平均Q30≥80% 等（Q20、Q30是什么意思，我们等下解释）。

        所以在拿到下机数据后，通常测序公司会进行数据过滤（比如去除接头序列、舍去质量太差的reads等质控），最后交付符合合同要求测序质量的数据。

        我们先来看看到我们手里的Illumina的数据长什么样子，我们可以用more命令查看：

        more xiaobai.fq

       上图显示的就是fastq（fq）格式的测序文件。这个格式曾在《小白生信学习记（一）》里简单说过。我们来复习一下，第1行是序列的名字。第2行是测的DNA序列。第4行则是测序质量值。1到4行组成了一条reads的完整信息。

        我们重点看一下这些质量值是什么意思。

        这些质量值是用下列的ASCII码表示的，ASCII码与数值的对应关系如下表（参考资料1）：

        ASCII码与测序质量值的对应关系，每个公司不一样，而Illumina公司本身不同时期也使用过不同的换算方式。如下图（参考资料2）：

       目前使用的，都是Illumina1.8+对应的换算方式。

       也就是L表示的那行：!是最低的质量，为0，而J是最高的质量，为41。以@为例，计算：查表可以知道 @ 对应的数值为64，但对于测序质量值来说，多了33（因为测序质量是从!开始用的），所以@ 对应的测序质量值应该为64-33=31。

       那为什么搞得这么复杂，而不用直接用数字表示？因为当质量比较高的时候，比如38，这个数值首先和原来的DNA序列的对应关系会变得复杂，且占用的存储也更多。

       这个质量值是什么意思？最初Sanger中心用Phred Quality Score来衡量该read中每个碱基的质量，Q=-10logP ，其中P代表该碱基被测序错误的概率，如果该碱基测序出错的概率为0.001，则Q应该为30，那么30+33=63，那么63对应的ASCii码为“？”，则在该碱基对应的质量值即“？”（参考资料1）。对应的，Q20表示碱基测序错误率为0.01。如下图（参考资料3）：

        我们继续往下走流程。

        在拿到这些质控后的数据后，我们也可以自己亲自用软件（如：Fastqc）查看一下数据是否符合要求。如果感觉还不满意，也可以自己使用软件进行质控（比如：trimmomatic，Trim Galore等软件）

       这些经过质量控制的数据，我们称其为clean data 。对应的，那些未经过质控的数据，我们称为raw data。

       这些clean data ，我们会使用一些软件（比如：HISAT2，tophat2，STAR等）把它们和参考基因组序列进行比对，寻找每个reads的最佳匹配位置。我们把这个过程称为Mapping。

       接着，统计每个基因或者转录本的表达量（软件：HTSeq，RSEM等）后，进行差异表达分析（edgeR, DEseq2, EBseq等）。

        为什么我们需要寻找差异表达的基因？举例来说，在正常条件和某种试剂处理的时候，出现了某些我们关心的特性，但是我们可能不知道这些特性的发生是什么机制。那我们可以通过寻找这些有变化的基因，分析它们大致是参与了什么过程的基因起了变化，就可以为进一步深入研究提供线索。

        那如何知道这些基因参与了什么过程？我们可以通过GO分析和KEGG通路分析来提供这方面信息。这部分内容今天暂不介绍。

       今天我们先简单介绍到这里。上面提到的内容，我之后都会更为详细地进行一一讲解，并且给出命令以及数据供大家练习。

       生物信息学的发展是非常迅速，软件也在快速迭代的。以GO分析为例：2002年-2008年之间的软件至少有68个之多（参考资料4）！所以本系列文章不在于教会大家某个软件非常具体的操作，而是希望通过某些软件的学习，大家逐渐了解生物信息以及linux系统的使用和编程入门。

参考资料1：http://blog.csdn.net/godsunshine/article/details/51946314

参考资料2：https://en.wikipedia.org/wiki/FASTQ_format#cite_note-Cock2009-1

参考资料3：https://en.wikipedia.org/wiki/Phred_quality_score

参考资料4:   Da Wei Huang等，Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists

欢迎关注我们